白细胞介素18(Interleukine-18, IL-18)是一种多效细胞因子，具有强烈的IFN-γ诱生能力，对机体起着重要的免疫调节和保护作用，在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力，因此IL-18可作为免疫佐剂与一些病原微生物的保护性基因共表达，从而加强疫苗的免疫效果或制备基因工程疫苗；由于鸡IL-18(ChIL-18)基因发现得比较晚，而对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道，且其具有与人和哺乳动物相似的生物学功能，因此ChIL-18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。pFastBacTMDual载体含有PH启动子和p10启动子，可以同时表达两个具有独立活性的外源蛋白。杆状病毒对脊椎动物无病原性，也不能在脊椎动物细胞内复制、表达，更不能把其基因整合到脊椎动物细胞染色体内，因此重组杆状病毒可以被认为遗传学上是安全的表达载体；外源基因因插入多角体蛋白基因的座位引起后者的缺失或灭活，因此重组病毒不产生包涵体，这不仅为重组病毒选择提供了标记，而且重组不能像野生型病毒那样在环境中长期存在，所以更安全。故本研究直接将未纯化的双表达蛋白进行免疫原性研究。

概述()
一、白细胞介素18的研究进展（）
二、鸡IL-18的研究进展（）
三、鸡IL-18对传染性法氏囊病疫苗免疫原性提高的
研究进展（）
四、鸡IL-18对禽流感免疫原性提高的研究进展（）
五、鸡IL-18在杆状病毒表达系统中表达的研究
进展（）
第一章ChIL-18原核表达蛋白复性研究()
第一节不同复性方法对rChIL-18原核表达蛋白复性率
和生物学活性的影响（）
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
第二节人工分子伴侣系统辅助rChIL-18原核蛋白复性
过程中影响因素的研究（）
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
第二章rChIL-18原核蛋白及真核表达质粒对IBDV灭活
疫苗免疫增强作用的研究()
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
第三章mChIL-18与IBDV VP2基因或AIV HA1基因
在pFastBacTMDual中的共表达及其免疫原性
研究()
第一节mChIL-18与VP2或HA1在杆状病毒表达
载体中的共表达（）
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
第二节双表达产物pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的
生物学活性检测（）
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
第三节双表达蛋白pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的
免疫原性研究（）
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
研究结果()
相关文章()
参考文献()
符号说明()
附录()

　　概述
　　一、白细胞介素18的研究进展
　　（一）IL-18的发现
　　1982年，Okmura等发现痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes,Pacnes)与丝裂原LPS合用能显著增加IFN-γ的分泌水平，推测有中介因子参与，但一直未能确定。1989年，Nakamura等从痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes,Pacnes)和细菌脂多糖(LPS)致内毒素休克的小鼠血清中分离出一种具有诱导产生IFN-γ活性的蛋白因子，研究发现，这种因子与IL-12有很多相同之处。1995年，Okamura等发现用Pacnes处理的小鼠再用抗CD3单克隆抗体刺激，可释放高水平的IFN-γ。随后用Pacnes接种小鼠，再用LPS诱导小鼠使其中毒休克，从其肝脏提取液中分离到一种均一多肽，约18KD。根据其中两个多肽片段的氨基酸序列合成寡核苷酸引物，以此为引物用RT-PCR将从小鼠肝脏中提取的mRNA扩增出一个不完全的cDNA片段，作为探针，筛选小鼠肝细胞cDNA文库，得到一全长的cDNA克隆，并在大肠杆菌中表达。因其可诱导IFN-γ产生，命名为γ-干扰素诱导因子(interferon gamma inducing factor,IGIF)(Okamura et al,1995)。1996年，Ushio等用鼠IGIF cDNA作为探针，从正常人肝脏cDNA文库中分离出人的IGIF cDNA。并在大肠杆菌(Ecoli)中表达，鉴于IGIF的氨基酸序列与已知数据库中的任何蛋白质均不相同，并且它除了能诱导IFN-γ产生外还有多种生物学活性，因此重新命名为白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)(Ushio et al,1996)。
　　（二）IL-18的分子结构
　　鼠IL-18(mIL-18)前体蛋白由192个氨基酸组成分子量238ku，N末端有一结构特殊的35个氨基酸组成的信号序列，无N端糖基化位点、无野生型疏水信号肽样位点。成熟mIL-18由157个氨基酸组成，分子量182ku，等电点PI = 49(Okamura et al,1995)。IL-18前体与IL-1β前体相似，没有生物学活性。但两者都有IL-1β转换酶(interleukin-1β-converting enzyme,ICE or Caspase-1)的加工位点天冬氨酸残基(Asp)，ICE可选择性地在特异性的位点切割，使之成为有活性的成熟蛋白(Ghayur,et al,1997;Gu et al,1997;Lorey et al,2004;Nagata et al,2002)。目前认为，小鼠的裂解位点是35Asp- 36Asn，人的IL-1β切割位点是36Asp-37Tyr。实验证明，ICE缺失的小鼠可以生成IL-18前体，但不能将其转换成有活性的IL-18。LPS不能在这种小鼠诱导生成IFN-γ(Fantuzzi et al,1998;Melnikov et al,2001)。另一方面，参与细胞凋亡的Caspase-3也能将IL-18前体蛋白和成熟体蛋白降解成无活性形式的降解型副产物，这也可能构成了IL-18一种潜在的负调节机制(Akita et al,1997;Ghayur et al,1997)。据报道，Proteinase-3也可以激发Pro-IL-18的生物学活性。但是，相比而言，Pro-IL-18或者成熟IL-18在76Asp-77Asn以及71Asp-72Ser之间被Caspase-3切开则产生了无活性生物肽(Sugawara et al,2001;Pirhonen et al,1999)。人白介素18(hIL-18)基因编码193个氨基酸前体蛋白，与mIL-18有65%同源性，N端也有类似的信号序列，亦无N端糖基化位点和疏水信号肽位点(Ushio et al,1996)。mIL-18和hIL-18都有IL-1类似的特征性结构(称为IL-1特征样序列)：phe-x(12)-phe-x-ser-x(6)-phe-leu。IL-18的空间结构由12股β片形成β-三叶折叠，这也与IL-1蛋白家族空间结构类似(Bazan et al,1996)。mIL-18可能定位于小鼠9号染色体糖尿病易感基因Idd2区间，推测hIL-18可能定位于IL-1β基因所在染色体2q13区间(Rothe et al,1997)。IL-12能诱导转录信号传导和激活Stat家族蛋白的Stat3、Stat4酪氨酸磷酸比，但用IL-18处理Th1细胞后Stat4酪氨酸磷酸比现象消失。这说明确切的IL-18信号传导路线尚在探索中。折叠识别分析表明，IL-18的蛋白质序列与IL-1β有19%的同源性，与IL-1α有12%的同源性。二者的空间结构是β折叠链，2个发夹结构，故整个结构共有12条反向平行的β折叠链和6个发夹结构。其中6条β折叠链、3个发夹结构形成一桶状结构，其中央是一个巨大的疏水核心，而另6条β折叠链和3个发夹结构在桶底部作三角形排列，形成一个“桶盖”。由于IL-18与IL-1有很多相似之处，两者可能来源于相同的祖先，故有人建议将IL-18命名为IL-1γ。
　　（三）IL-18的分布及产生
　　免疫或非免疫细胞都可产生IL-18，人和鼠的IL-18主要由巨噬细胞产生，如单核巨噬细胞，肝脏Kupffer细胞等。现已发现在小鼠表皮角化细胞、成骨细胞、小肠上皮细胞以及大鼠的肾上腺皮质网状带和束状带细胞均可表达IL-18。小鼠的IL-18主要由肝脏中的Kupffer细胞产生，外周血单核细胞经LPS刺激也有IL-18 mRNA的表达。现已发现在小鼠表皮角化细胞、成骨细胞、小肠上皮细胞以及大鼠的肾上腺皮质网状带和束状带细胞均可表达IL-18(Gracie et al,2003;Wheeler et al,2003)。人IL-18的细胞来源还不确定，外周血中只有单核巨噬细胞不经诱导即可表达IL-18mRNA，而T、B细胞中几乎检测不到。ConA或PHA刺激的外周血中IL-18mRNA的表达量没有明显改变，提示

　　前言
　　白细胞介素18(Interleukine-18,IL-18)是一种多效细胞因子，具有强烈的IFN-γ诱生能力，对机体起着重要的免疫调节和保护作用，在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力，因此IL-18可作为免疫佐剂与一些病原微生物的保护性基因共表达，从而加强疫苗的免疫效果或制备基因工程疫苗；由于鸡IL-18(ChIL-18)基因发现较晚，而对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道，且其具有与人和哺乳动物相似的生物学功能，因此ChIL-18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。pFastBacTM Dual载体含有PH启动子和p10启动子，可以同时表达两个具有独立活性的外源蛋白。杆状病毒对脊椎动物无病原性，也不能在脊椎动物细胞内复制、表达，更不能把其基因整合到脊椎动物细胞染色体内，因此重组杆状病毒可以被认为遗传学上安全的表达载体。外源基因因插入多角体蛋白基因的座位引起后者的缺失或灭活，因此重组病毒不产生包涵体，这不仅为重组病毒选择提供了标记，而且重组不能像野生型病毒那样在环境中长期存在，所以更安全。故本研究直接将未纯化的双表达蛋白进行免疫原性研究。
　　传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由IBD 病毒(IBDV)感染雏鸡引起的以淋巴组织，特别是中枢免疫器官——法氏囊为主要特征的高度接触性传染病。该病主要导致机体免疫抑制，使机体的免疫能力降低和疫苗免疫接种失败。虽然灭活疫苗和减毒活疫苗是相当成熟的，但由于IBDV强毒株和抗原变异的出现使其免疫效价降低。VP2 是IBDV的主要保护性抗原，已经鉴定的IBDV中和表位主要在VP2 上，并且多为构象依赖性，这意味着VP2 的立体结构对其中和表位的形成至关重要，与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异以及细胞凋亡的诱导等有关。
　　禽流感(Avian influenza,AI)是由AI病毒(AIV)感染引起的一种高度接触性人畜共患传染病。HPAI 的暴发给养禽业带来了一定的经济损失，H5N1亚型AI的出现不仅产生经济损失，还带来了恐慌。AIV的主要抗原决定簇都位于HA1区域。体外表达HA1涵盖了所有的HA空间中和表位，故其完全可以替代HA作为抗原。所以HA1蛋白是研制基因工程亚单位苗的理想候选抗原。
　　本试验利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，选用pFastBacTM Dual双表达载体，在昆虫细胞中共表达mChIL-18基因蛋白和IBDV VP2基因蛋白或H5型AIV HA1基因蛋白，并对未纯化蛋白生物学活性进行分析；进而研究未纯化蛋白免疫原性。为进一步研究VP2基因工程疫苗、HA1基因工程疫苗的免疫效果以及mChIL-18在IBD、AI的免疫调节作用等相关研究奠定基础。
　　一、ChIL-18原核表达蛋白复性研究
　　研究利用不同的复性方法辅助rChIL-18原核表达蛋白的复性，以提高鸡IL-18重组蛋白复性率，获得更多具有良好活性的蛋白。将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3），并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。表达产物主要以包涵体的形式存在。包涵体经超声波破碎、洗涤后以6mol/L的盐酸胍溶解，使蛋白彻底变性,然后利用盐酸胍-去离子水透析法、盐酸胍-谷胱甘肽变性复性法和人工分子伴侣系统法分别辅助蛋白复性。复性产物经透析纯化后，利用淋巴细胞增殖试验来检测其活性。经SDS-PAGE分析表明,表达产物是与ChIL-18重组蛋白相符的Mr约44000的蛋白条带。利用人工分子伴侣系统辅助复性的方法获得的复性率最高，复性率为4254％。鸡淋巴细胞增殖试验表明,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导增殖作用。上述试验显示，人工分子伴侣系统能够较好地辅助鸡IL-18重组蛋白复性，获得较高的复性率。其产物具有良好的生物学活性,为下一步鸡IL-18重组蛋白的应用研究奠定了试验基础。
　　将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3），并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。表达的包涵体经超声波破碎、洗涤后以6mol/L的盐酸胍溶解，使蛋白彻底变性。然后按照试验设计，考察不同浓度组成的人工分子伴侣体系对不同浓度鸡IL-18重组蛋白复性率的影响。试验结果表明，利用人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白的复性存在最佳的条件，优化该条件能够提高该融合蛋白的复性率，且产物都具有良好的生物学活性，为鸡IL-18重组蛋白的进一步应用研究奠定了试验基础。
　　二、鸡IL-18原核表达蛋白及真核表达质粒对IBDV灭活疫苗免疫增强作用的研究
　　本研究室在2001年开展鸡白细胞介素18（ChIL-18）的研究，先后构建ChIL-18的重组质粒和原核表达系统、真核质粒及其表达系统，在此基础上，对纯化后的原核表达的重组鸡白细胞介素18产物进行生物学活性检测，对其在生产中的应用做了初步研究，同时对影响ChIL-18原核表达产物生物学活性的因素也进行了探讨。将鸡IL-18原核表达蛋白的复性产物和真核表达质粒pcDNA31TOPO-mChlL18分别与IBDV灭活疫苗联合应用，通过中和抗体检测和T淋巴细胞对ConA增殖反应试验，研究其对IBDV灭活疫苗的免疫增强作用。结果显示，在接种后第21、28、35及42天时蛋白组和质粒组